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基因捕获的基本原理:
基因捕获的方法酷似以报告基因为诱饵来捕获基因。其基本过程是将一含报告基因的DNA 载体随机插入基因组,从而产生内源基因失活突变,并通过报告基因的表达激活提示插入突变的存在,及突变内源基因表达特点 。通过筛选得到的插入突变的ES 细胞克隆经囊胚注射转化为基因突变动物模型,进而分析表型来研究突变基因功能。每一种ES 细胞克隆中含有不同的突变基因,在短期内可建立大量含不同基因突变的ES 细胞克隆库。突变基因的序列可通过基于PCR 的一些方法鉴定,同时还可能发现一些在体内表达或不表达的新基因 。
基因捕获的分类:
增强子捕获载体
含有一个最小的启动子和翻译起始位点,当载体整合到顺式增强子元件附近时,此增强子将调控报告基因的表达 。对报告基因在体内表达的ES 细胞系插入位点进行克隆鉴定发现插入位置邻近编码序列。关于增强子捕获的诱变比率还未见报道,但插入的性质预示由增强子捕获产生功能失活的突变比率较低,因此,增强子捕获载体在小鼠体系中未得到广泛应用。
启动子捕获载体
通常由不含启动子成分的报告基因和一筛选标记基因组成,只有当载体插入到内源基因编码区序列中产生融合转录本时报告基因才可能表达 。因而启动子捕获的致突变比率很高。然而载体插入到外显子的频率非常低,捕获效率较增强子捕获至少低200倍。故载体中通常含有一个筛选标记基因,如新霉素抗性基因( neo) 或β-半乳糖苷酶(galactosidase) 与neo 的融合基因(β-GEO) ,保证载体插入的细胞克隆被筛选保留 。由于插入发生在DNA 转录区,克隆插入位点就可确定突变基因。
基因捕获载体
中在无启动子序列的报告基因上游和下游分别含有剪接受体( splice acceptor ,SA) 和多聚腺苷酸加尾序列(polyA) ,当含有顺式作用的启动子和增强子元件被捕获基因转录激活时,载体中SA 与内源基因剪接供体( splice donor ,SD) 作用产生上游内源基因编码序列与报告基因融合转录本,使内源基因发生突变,同时报告基因的表达提示内源基因的表达特点。融合转录产物可作为克隆突变基因序列的模板 。由于插入发生在内含子中,基因捕获的效率较启动子捕获至少提高50 倍。然而选择性剪接(alternative splicing) 的发生会导致低水平的野生型转录本产生而形成减效等位基因突变 。
(1)最常用的报告基因大多是编码抗生素抗性蛋白的基因,通过检查产物是否具有抗生素的抗性来确定基因的表达情况 。
(2)氯霉素乙酰基转移酶(CAT):该报告基因来源于大肠杆菌转位子9,是第1个用于检测细胞内转录活性的报告基因。氯霉素乙酰基转移酶可催化乙酰CoA的乙酰基转移到氯霉素3羟基 ,而使氯霉素解毒。CAT在哺乳细胞无内源性表达,性质稳定,半衰期较短 ,适于瞬时表达研究 。可用同位素、荧光素和酶联免疫吸附测定(enzyme—linkedimmunosorbantassay,ELISA)检测其活性,也可进行蛋白质印迹(Westernblotting)和免疫组织化学分析。CAT与其他报告基因相比 ,线性范围较窄,灵敏性较低。
(3)β半乳糖苷酶:β半乳糖苷酶由大肠杆菌lacZ基因编码,可催化半乳糖苷水解。最大优势是易于用免疫组织化学法观测其原位表达 ,是最常用的监测转染率的报道基因之一 。以邻—硝基苯—β—D—半乳吡喃糖苷(ONPG)为底物可用标准的比色法检测酶活性,其检测动力学范围为6个数量级。氯酚红—β—D—半乳吡喃糖苷(CPRG)是另一个可用比色法检测酶活性的底物,其灵敏度比ONPG高近10倍。以MUG和荧光素二半乳糖苷(FDG)为底物则可用荧光法检测其活性 。此法可检测单个细胞的酶活性 ,并可用于流式细胞学(FACS)分析。如以二氧杂环丁烷为底物,可用化学发光法检测酶活性,其检测动力学范围最大,灵敏度最高 ,与用生物发光法检测荧光素酶活性的灵敏度相似。
(4)荧光素酶:荧光素酶是能够催化不同底物氧化发光的一类酶,哺乳细胞无内源性荧光素酶 。最常用的荧光素酶有细菌荧光素酶 、萤火虫荧光素酶和Renilla荧光素酶。细菌荧光素酶对热敏感,因此在哺乳细胞的应用中受到限制。萤火虫荧光素酶灵敏度高 ,检测线性范围宽达7~8个数量级,是最常用于哺乳细胞的报道基因,用荧光比色计即可检测酶活性 ,因而适用于高通量筛选 。随着具有膜通透性和光裂解作用的萤火虫荧光素酶的应用,无需裂解细胞即可检测酶活性。Renilla荧光素酶催化肠腔素(coelenterazine)氧化,产物可透过生物膜 ,可能是最适用于活细胞的报告分子。将荧光素酶报告基因载体转染到细胞中,可用荧光素酶检测系统灵敏方便地测定荧光素酶基因的表达 。自1986年起,萤火虫荧光素酶基因被用作测定基因表达的报告基因 ,获得了广泛的应用。Promega公司的pGL3及pGL2系列载体,含SV40启动子及增强子的不同组合,有助于分析DNA片段的转录活性。
荧光素酶报告基因有许多优点:①非放射性;②比CAT及其他报告基因速度快;③比CAT灵敏100倍;④荧光素酶在哺乳细胞中的半衰期为3小时,在植物中的半衰期为3.5小时。由于半衰期短 ,故启动子的改变会即时导致荧光素酶活性的改变,而荧光素酶不会积累 。相反,CAT在哺乳细胞中的半衰期为50小时。荧光素酶浓度在10—16mol/L(10pS/L)到10-8mol/L(1mg/L)范围内 ,荧光信号强度与酶浓度成正比。在理想条件下,可检测到l0-20mol/L的荧光素酶 。Promega公司的荧光素酶检测系统比一般的方法灵敏及简单,产生的光稳定。
(5)分泌型碱性磷酸酶(SEAP):SEAP是人胎盘碱性磷酸酶的突变体 ,无内源性表达。SEAP缺乏胎盘碱性磷酸酶羧基末端的24个氨基酸 。其优点是无需裂解细胞,只用培养介质即可检测酶活性,便于进行时效反应试验。以间硝基苯磷酸盐(PNPP)为底物时可用标准的比色法测定酶活性 ,操作简单,反应时间短,价格廉价 ,但灵敏度低。以黄素腺嘌呤二核苷酸磷酸为底物进行比色测定,其灵敏度增高 。SEAP可催化D—荧光素—O—磷酸盐水解生成D—荧光素,后者又可作为荧光素酶的底物,此即两步生物发光法检测酶活性的原理。此方法灵敏度高 ,接近于荧光素酶报告基因的检测。还可用一步化学发光法检测酶活性 。
(6)荧光蛋白家族:荧光蛋白家族是从水螅纲和珊瑚类动物中发现的相对分子质量为20 000~30 000的同源蛋白。绿色荧光蛋白(GFP)是应用最多的发光蛋白。GFP存在于发光水母(AequoreaVictoria)中。用395 Bin的紫外线和475 nm的蓝光激发,GFP可在508nm处自行发射绿色荧光,无需辅助因子和底物 。GFP最大的优势是无需损伤细胞即可研究细胞内事件。1991年克隆了GFP基因 ,已获得几个突变体,如“红色迁移 ”突变体(red—shiftmutant),其荧光更强。其他突变体还有蓝色荧光蛋白(BFP)、增强型GFP(EGFP)和去稳定EGFP(destabilizedEGFP)等 。红色荧光蛋白(RFP)是从珊瑚(Discosoma sp.)中分离的发光蛋白(drFP583或DsRed) ,可发射明亮的红色荧光。这些常用的报告基因也可被联合应用,同时检测2个甚至3个基因的表达。报告基因的选择依赖于其灵敏性、可靠性及监测的动力学范围 。稳定性好的报告基因适于基因转录动力学研究和高通量筛选,尤其适用于基因转移的定性研究。
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